细胞信号通路分析

细胞信号通路的分析设计的关键步骤是蛋白质定量问题。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，已经广泛应用于遗传病的诊断。RT-PCR的关键步骤在于RNA的反转录，要求RNA模版尽量为完整且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即禽成骨髓细胞性白细胞病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia vrius,MMLV)逆转录酶，以及来自于MMLV逆转录酶的两个组氨酸突体RNA酶，即市售的SuperScript I和SuperScript II。RT-PCR以其灵敏、快速、需要样本量小等优点，成为人们分析基因表达过程中首选的一种方法。近来，由于实时荧光定量PCR(real-time PCR)的进展，该方法大大拓展了RT-PCR技术的应用范围。齐氏生物还提供其他RNA定量的方法还有Nothern blotting、NASBA (van Gemen et al. 1994)和bDNA (Urdea 1993)。他们通常应用于测量已知的RNA种类，如病毒基因组RNA。

1、主要操作步骤
①引物和探针的设计以及优化
②模板制备
a:从血液中提取DNA/RNA标本
b:从组织中提取DNA/RNA标本
c:从纯培养的标本中DNA/RNA标本
③反应体系和PCR条件的建立和优化
④定量标准曲线的建立
⑤ 不同荧光物质反应条件的优化(SYBR Green I、TaqMan、Molecular Beacon、Lightcycler等)
⑥ 样本DNA/cDNA的检测(包括内参)
⑦ 数据处理与统计
⑧实验完成后，提供完整的实验报告及实验材料
2、实时荧光定量PCR的应用
①临床常见病原体的检测：
②食品安检中病原菌的检测
③动物检疫中病原体的检测
④肿瘤研究
a:标志物特异性基因的检测
b:微小残留病变的检测
c:肿瘤药物的耐药性的检测
⑤基因表达的差异研究：检测不同细胞/组织的mRNA表达差异
⑥细胞因子表达的分析，如白介素、干扰素、CSF、TNF、TGF、MCP-1、MIP-1等
⑦遗传学诊断，如血友病、镰刀状贫血病等
⑧基因突变及SNP分析